به سایت ژینو ژن پژوهان خوش آمدید



بلاگ

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز چیست؟

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا polymerase chain reaction که به اختصار PCR نامیده می‌شود یک تست و تکنیک نسبتا جدید در دنیای زیست شناسی مولکولی می‌باشد. به وسیله این تست می‌توان از یک نسخه منفرد یا تعداد کمی نسخه موجود از اسید نوکلئیک (DNA یا RNA) تعداد زیادی (در مقیاس میلیون) از آن را تولید کرد به گونه ای که آن مقدار حاصل شده باعث مشاهده آن‌ها توسط روش‌های ساده و رایج آزمایشگاهی شود. در این تکنیک آسان و ارزان قیمت یک قطعه خاص و لازم از DNA در جهت تشخیصی یا درمانی تکثیر می‌یابد. اهدافی چون تشخیص و نظارت بر بیماری‌های ژنتیکی، تشخیص بیماری‌های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی و شناسایی مجرمان (در زمینهٔ پزشکی قانونی)، تشخیص عوامل بیماری‌زا و مطالعه عملکرد یک بخش هدف از DNA (آنالیز عملکرد ژن‌ها ) و... مورد نظر است.

تاریخچه ابداع PCR

ابداع این تکنیک در سال 1983 بوسیله کری مالیس (Kary Mullis ) بود. در طی حدودا 150 سالی که از ابداع این تکنیک گذشته است پتانسیل‌های PCR از جمله حساسیت و سرعت بالا باعث شده که این تست بسیار متداول و غالبا ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های تحقیقاتی باشد. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت بخاطر کار روی PCR و بهبود و گسترش این تکنیک جایزه نوبل شیمی را از آن خود کردند. در طول این سال‌ها دو پیشرفت تکنیکی بسیار مهمی باعث اصلاح روند PCR شده است. اولین پیشرفت استفاده از پلیمرازهای مقاوم به حرارت و پیشرفت دوم به کارگیری ترمال سایکلرها ( cycler Thermal ) بوده است.

اساس واکنش PCR چیست و چگونه انجام می‌گیرد؟

اساس تکنیک PCR چرخه‌های حرارتی است. در این چرخه‌ها دوره‌های گرمایی و سرمایی تکرار شونده، ذوب DNA و تکثیر آنزیمی DNA انجام می‌گیرد. در تکنیک PCR اصول اولیه فرایند طبیعی سنتز DNA و همانندسازی مولکول‌های DNA درداخل لوله آزمایش کپی می‌شود. برای تقسیم سلولی در داخل سلول‌های زنده نیاز به تکثیر DNA می‌باشد و این تکثیر و همانندسازی توسط سیستمی پیچیده که متشکل از تعداد فراوانی پروتئین است انجام می‌ گیرد. طی فرایند PCR الگوی DNA به صورت لگاریتمی تکثیر می‌شود و DNA تکثیر شده خود به عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده می‌شود. در این فرایند دو رشته DNA از هم باز می‌شوند و از روی هر رشته مولکول مادر، به عنوان الگو یک رشته جدید ساخته می‌شود تا در نهایت DNA دختری ایجاد شود. پس DNA دختری دارای یک رشته جدید و یک رشته قدیمی به ارث رسیده از مادر است. فرایند این نسخه برداری، همان قانون معروف واتسون و کریک است: A همواره با T و G همواره با C جفت می‌شود. PCR مشابه یک دستگاه فتوکپی است و تمام این مراحلی را که در سلول انجام می‌گیرد تکرار می‌کند و همانند دستگاه فتوکپی که نیاز به موادی مثل کاغذ، جوهر و سخت افزار دارد، PCR نیز نیازمند مواد اولیه خاصی است.

پنج جزء اصلی برای انجام PCR مورد نیاز است که در ادامه به نقش دقیق هر کدام از آن‌ها بیشتر بحث خواهیم کرد

• رشته‌های کوتاهی از DNA (اولیگو نوکلئوتیدها) که حاوی توالی مکمل ناحیه هدف اند و پرایمرنام دارند. پرایمرها آغازگر واکنش PCR هستند و به وسیله تکنیک‌های شیمیایی مخصوصی با سرعت و در عین حال ارزان ساخته می‌شوند.
• واحدهای ساختمانی DNA به نام نوکلئوتیدها (dNTPها) که برای ساخت رشته جدید مورد استفاده قرار می‌گیرند.
• آنزیم Taq پلیمراز که بازهای جدید را به ساختار DNA می‌افزاید.
• بافر نیز شرایط مناسب انجام آزمایش PCR را فراهم می‌کند. تریس هیدرو کلراید، پتاسیم کلراید، منیزیم، ژلاتین و دترجنت‌های غیر یونی انواعی از بافرهای مورد استفاده ی PCR هستند.

تجهیزات اصلی موردنیاز این تست هم شامل موارد زیر می‌شود

• ظرف حاوی یخ
• میکروسانتریفیوژ
• دستگاه ترموسایکلر
• تانک الکتروفورز

مراحل انجام PCR

1. تقلیب یا دناتوراسیون (Denaturation) DNA: در این مرحله DNAی الگو تا دمای ۹۵-۹۴ درجه سانتی گراد تحت حرارت قرار می‌گیرد. این دمای بالا باعث می‌شود که پیوندهای هیدروژنی که بین بازهای موجود در دو رشته DNA قرار گرفته اند شکسته شوند و دو رشته DNA جداگانه و جدید حاصل گردد. در نهایت از این دو رشته به عنوان الگوی ساخت رشته‌های جدید DNA استفاده می‌کنند. انجام این فرایند معمولا ۳۰-۱۵ ثانیه طول می‌کشد. پس در پایان مرحله دناتوراسیون از هر مولکول DNA، دو DNA تک‌رشته‌ای ساخته می‌شود.
2. پیوند زنی یا اتصالAnnealing) ): در این مرحله کاهش دما تا حدود ۶۵-۵۰ درجه سانتی گراد را داریم تا پرایمرها بتوانند به نقاط مخصوص خود در DNA تک رشته ای متصل شوند. البته شایان ذکر است که دمای دقیق به نقطه ذوب پرایمر مورد استفاده بستگی دارد و برای پرایمرهای مختلف متفاوت است. پرایمرها توالی‌هایی از DNA یا RNA هستند، به صورت تک رشته ای اند و حدودا 20 تا 30 باز دارند و انتهای ۳ پریم مورد نیاز برای آغاز فعالیت پلیمراز و سنتز DNA را تهیه می‌کنند.
آنزیم DNA پلیمراز تنها زمانی می‌تواند شروع به عمل کند و رشته ی جدید و مکمل را بسازد که پرایمر به عنوان تعیین کننده نقطه شروع به DNA متصل شده باشد. مدت زمان این مرحله همانند مرحله قبل بوده و حدود ۳۰-۱۰ ثانیه می‌باشد.
3. توسعه یا گسترش (Extending): در مرحله سوم دوباره دما افزایش می‌یابد (حدود 70 درجه سانتی گراد) و رشته جدید توسط آنزیم Taq پلیمراز شروع به ساخته‌شدن می‌کند.
این سه مرحله در مجموع حدود ۲۰ الی ۴۰ بار انجام می‌گیرد و در هر مرتبه تعداد کپی‌های تهیه شده از هر DNA با لگاریتم دو چند برابر می‌شود. در واقع از هر DNA دو DNA جدید ساخته می‌شود.
اتمام یک آزمایش PCR حدود یک ساعت بعد از شروع آن است. البته مدت زمان انجام آن به سرعت دستگاه‌ها نیز بستگی دارد و زمان دقیقی را نمی‌توان برای آن تعیین کرد.
پس از انجام شدن PCR، از تکنیک الکتروفورز برای جداسازی قطعات تولید شده براساس اندازه ی آن‌ها استفاده می‌شود.

و در پایان خبر خوب این است که در در آزمایشگاه تحقیقاتی ژینو ژن پژوهان شرایط مورد نیاز برای انجام این تکنیک حساس و مطمئن فراهم شده است تا محققان، دانشجویان و... برای انجام تحقیقات خود در محیط مناسب بتوانند از آزمایشگاه‌های استاندارد و با امکانات این مجموعه استفاده کنند.

خواندن 47 بار آخرین تغییر در یکشنبه, 21 شهریور 1400 12:48
به این مطلب امتیاز دهید
(0 امتیازات)
بیشتر در این مجموعه: ژنتیک سرطان »

پیام بگذارید

اطمینان حاصل کنید که تمام اطلاعات مورد نیاز را که با ستاره نشان داده شده است وارد کنید (*). کد HTML مجاز نیست